Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод исследования, который используется для выявления наличия определенных генетических материалов в образцах биологической среды человека, животных и растений. Если сократить область применения данного метода, то создается ПЦР-диагностика – исследование, которое позволяет выявить возбудителя разной природы за считанные часы.

Чем же привлекает ПЦР-диагностика? Стоит отметить, что она обладает рядом неоспоримых преимуществ перед другими методами анализа. Первое и, пожалуй, главное ее преимущество – абсолютная точность. В отличие от других анализов, которые могут дать явные ошибки, издержки или просто неправильные результаты, метод ПЦР безошибочно определяет наличие своих объектов исследования.

Особенностью ПЦР-диагностики является то, что даже малейшее количество генетического материала возбудителя можно обнаружить в биологическом образце. Отдельно стоит отметить, что метод может применяться для выявления нескольких заболеваний сразу, что упрощает и ускоряет процесс постановки диагноза.

Описав основные преимущества данного метода, следует обратить внимание на этапы проведения ПЦР-диагностики. Уже на начальной стадии данной процедуры изучают образец биоматериала (кровь, мазок из носоглотки, слюна, моча, сперма и так далее) и анализируют его качество и количество.

Далее начинается основной этап ПЦР-диагностики: в рамках реакции биоматериал смешивается с реагентами и попадает в определенную термическую зону. Внутри нее проводится ряд технологических операций, в результате которых возбудитель переходит в состояние, когда его можно обнаружить. Финальный этап – получение результатов исследования.

Итак, ПЦР-диагностика является надежным и точным методом исследования, который уже несколько лет назад стал одним из главных инструментов врачей при постановке диагнозов в области инфекционных и вирусных заболеваний.

Существует целый ряд методов диагностики различных заболеваний, однако диагностика методом ПЦР зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. Методом ПЦР занимаются уже более 30 лет, и за это время он значительно эволюционировал.

Основой метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. Этому способствуют ферменты и изменения температуры (от 50 до 95°С). В результате процесса, называемого амплификацией, из одной молекулы ДНК возбудителя в биологической пробе пациента образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Процесс образования новой молекулы ДНК занимает около 3 минут, и после тридцати-сорока циклов новых молекул становится достаточно для проведения подробного анализа методом электрофореза.

В дополнение к простой амплификации фрагментов ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Из-за этих возможностей ПЦР может использоваться не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

Процедура ПЦР-диагностики проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. Сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов РНК. В некоторых модификациях можно использовать режим амплификации при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Широко применяется такой прием, как «горячий старт ПЦР», при котором пробирки с амплификационной смесью предварительно прогревают при температуре 95°С в течение 3–5 минут, для того чтобы избежать клонирования неспецифических ДНК-фрагментов.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Этот метод не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет использовать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше повышает точность использования ПЦР-диагностики.

Одним из наиболее востребованных методов анализа в клинической медицине является ПЦР-диагностика. Этот метод находит применение в самых различных сферах.

В области урогинекологии ПЦР-диагностика используется для выявления половых инфекций, характеризующихся слабой выраженностью симптомов и часто вызывающих бесплодие и невынашивание беременности у женщин. При помощи ПЦР можно выявить наличие целого «букета» инфекций, включая хламидиоз, несколько видов микоплазмы, уреаплазму, трихомониаз, гарднереллу, кандиду, гонококк и трепонему. Кроме этого, времянка и точность ПЦР-диагностики позволяют выявить генитальный герпес и вирус папилломы человека, предотвращая риск развития злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.

В неонатологии ПЦР-диагностика эффективно выявляет наличие неонатальных инфекций у плода уже в утробе матери и у новорожденных. Среди опасных заболеваний отмечаются цитомегаловирус, токсоплазмоз, вирусы краснухи и герпеса, хламидии и микоплазмы.

Пациентам, инфицированным опасными заболеваниями крови или плазмы, такими как ВИЧ, сифилис, гепатиты, также требуется ПЦР-диагностика для избежания риска переливания крови. Метод ПЦР значительно превосходит по точности серологические методы, позволяя выявлять даже инфекции, имеющие длительный инкубационный период, которые не могут быть обнаружены обычными исследованиями в первые несколько недель.

В клинике инфекционных заболеваний ПЦР-диагностика применяется для выявления различных инфекций, включая вирусы гепатита, СПИД, холеры, бруцеллеза, туляремии, дифтерии и токсоплазмоза.

В фтизиатрии и пульмонологии ПЦР-диагностика является неоценимым инструментом для выявления возбудителей атипичных форм пневмонии и хронических рецидивирующих бронхитов, таких как хламидии и микоплазмы. Этот метод также позволяет проводить видовую идентификацию возбудителя и своевременно поставить диагноз туберкулеза.

Помимо клинической медицины, ПЦР-диагностика находит применение в криминалистике, экспериментальной медицине, создании генетических паспортов, мониторинге состояния окружающей среды, анализе продуктов питания, фармакологии и ветеринарии.

Переваги ПЦР-діагностики

Незважаючи на те, що ПЦР-діагностика - метод відносно "молодий", вона отримала широке поширення в медичній практиці через переваги, які надає перед іншими методами аналізу:

• Пряме визначення збудника інфекції. Деякі традиційні методи, такі як імунноферментний аналіз (ІФА), виявляють лише білки-маркери, які є продуктом життєдіяльності збудників інфекції, тому вказують на присутність мікроорганізмів лише косвено. Присутність специфічної послідовності в ДНК, виявленої за допомогою ПЦР, без помилок або майже без помилок показує присутність конкретної інфекції.
• Висока специфічність методу. Вона обумовлена тим, що в досліджуваному матеріалі виявляється фрагмент ДНК, характерний лише для конкретного збудника інфекції. Специфічність ісключає можливість помилкових результатів аналізу, тоді як у імунологічних методах досліджень помилки здійснюються же з моною через перехресну реакцію антигенів.
• Висока чутливість. За допомогою ПЦР-діагностики можна виявити присутність в організмі навіть одиничних клітин вірусів або бактерій в тих випадках, коли звичайними методами це майже неможливо зробити. ПЦР виявляє наявність всього 10–100 кліток в пробі, тоді як імунологічними та мікроскопічними тестами можна виявити наявність інфекції при кількості клітин не менше 103–105.
• Універсальність. Схожість складу всіх ДНК або РНК дає можливість використовувати універсальні методи лабораторних досліджень, діагностікуючи відразу кілька збудників з однієї біологічної проби.
• Швидкість отримання результатів. Оскільки для проведення ПЦР-діагностики не потрібен посів та вилучення культури збудника, то і багато часу на неї не потрібно. Весь цикл – від збору біоматеріалу до отримання результатів – займає 4–5 годин.
• Діагностика латентних інфекцій. ПЦР-методом діагностуються складно культивовані і некультивовані форми мікроорганізмів, які відбуваються в тих випадках, коли захворювання перебігає в прихованій формі.
• Визначення збудника інфекції в інших матеріалах. За допомогою методу ПЦР можна виявити збудників інфекції не тільки в організмі людини, але і в грунті, воді, продуктах харчування.

Ограничения ПЦР-диагностики

Не смотря на то, что ПЦР-диагностика является одним из самых эффективных и популярных методов диагностики, у неё есть свои ограничения. Однако, это ограничения настолько незначительны, что не могут негативно сказаться на эффективности метода.

Ограничения метода включают следующее:

• Вероятность амплификации ДНК не только живых, но и погибших микроорганизмов.
• Возможность возникновения перекрестной реакции.
• Изменчивость микроорганизмов.

Для контроля эффективности лечения при проведении ПЦР-диагностики необходимо соблюдать определенные требования. Например, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1-2 месяца), за который происходит полное исчезновения возбудителя инфекции в организме.

Теоретически, перекрестная реакция может возникнуть, если фрагменты ДНК праймеров будут совпадать с фрагментами ДНК, присутствующими в других микроорганизмах, чей геном на данный момент еще не расшифрован.

За счёт изменчивости микроорганизмов некоторые его штаммы могут стать неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики разрабатывались для того, чтобы уменьшить риски ложноположительных результатов анализа, и включающие проверку на перекрестные реакции, а также тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Метод ПЦР имеет несколько этапов, которые проводятся в специальной лаборатории.

Первым этапом является забор биоматериала. Эта процедура проводится с помощью стерильного оборудования и только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть различные эпителиальные соскобы, моча, мокрота, кровь, сыворотка, плазма, биологические жидкости, а также биоптаты. Запрещено попадание следов крови в материал.

Следующий этап - хранение и транспортировка биоматериала. Образцы можно хранить на комнатной температуре в течение не более 2 часов или в холодильнике на температуре 2-8°С не более 1 суток. Некоторые биоматериалы допускают замораживание на срок до 2 недель, но оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Если требуется транспортировка, то пробы следует помещать в специальные термоконтейнеры или термосы.

Далее производится выделение ДНК из образца методом твердофазной сорбции. Затем в микроцентрифугу добавляется амплификационная смесь, после чего пробы устанавливаются в программируемый термостат и проводится амплификация. Время проведения зависит от заданной программы и составляет 2-3 часа.

После амплификации проводится регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяется методом электрофореза и образуется светящаяся полоса при облучении ультрафиолетовым излучением. Наличие светящейся полосы в ультрафиолетовом свете свидетельствует о положительном результате.

Интерпретация результатов исследования позволяет сделать выводы о наличии или отсутствии инфекции в организме человека. Количественный результат ПЦР-анализа может помочь врачу определить степень активности заболевания и выбрать соответствующее лечение.

Диагностика методом ПЦР: какие цены на проверку инфекций?

Стоимость диагностики методом ПЦР напрямую зависит от вида изучаемой инфекции, количества анализов, а также от качества и способа тестирования. Врачебные клиники устанавливают свои цены, что может привести к различиям в стоимости одного и того же анализа в разных клиниках.

За проведение диагностики одной инфекции обычно просят от 200 до 800 рублей, но стоимость может меняться в зависимости от медицинского учреждения. Кроме того, следует учитывать, что к оплате за диагностику нередко добавляется плата за взятие биоматериала, чья стоимость составляет около 400 рублей. В следующей таблице представлены приблизительные цены на некоторые виды ПЦР-анализов в Москве:

Помимо этого, многие клиники проводят комплексную диагностику, включающую сразу несколько анализов. Так, например, клиника может предложить комплексный анализ "ПЦР-8" на 8 бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций за 1400 рублей или "ПЦР-12" на 12 половых инфекций за 3500 рублей. Такой подход к диагностике может существенно снизить затраты на проверку на инфекции, так как при прохождении анализов по отдельности цены могут быть гораздо выше.

Фото: freepik.com